金银花中绿原酸的分离纯化-j9九游会九游国际版

      

摘要:目的 建立金银花中绿原酸的色谱分离纯化方法.方法采 用亲脂性吸附树脂与葡聚糖凝胶色谱纯化技术,将其水提物经亲脂性吸附树脂柱色谱预分离后,0.1mol/l-1盐酸调节ph到4.0左右,葡聚糖凝胶sephadexlh-20精制纯化,洗脱溶剂为5o%丙酮水溶液.结果产品经ms、红外、紫外和hplc图谱鉴定,并与对照品比较对照,结果显示所得的绿原酸纯度>98%.结论该方法简单,重复性较好,可用于绿原酸单体成分的制备.
    关键词:绿原酸;金银花;分离纯化;聚酰胺;葡聚糖凝胶
    0 前言
    绿原酸(chlorogenic acid,化学名3-0-caffeoylquinic acid),是由咖啡酸和奎宁酸组成的缩酚酸,属于苯丙素类化合物,广泛分布忍冬科、蔷薇科、菊科、茜草科合杜仲科等植物中,是杜仲、金银花等传统中药****、****的主要药效成分.
    绿原酸的分布、提取和生物活性已有相关的报道.目前已有的提取分离方法有β-cd包合、无机盐沉淀、酶法和制备型高效液相色谱法等,刘世名等采用polyamidesc-6分离纯化、lc-ms联用技术鉴定牛蒡叶中的绿原酸.已有的方法存在分离步骤繁琐、工艺复杂、设备成本过高等不足,*终产品不能作为对照品使用.本文提出一种聚酰胺前处理结合sephadex lh-20凝胶色谱纯化金银花中绿原酸的方法,得到的产品纯度大于98%.该法稳定、快速、高效,解决了新药开发中绿原酸对照品的制备问题.
    1 实验部分
    1.1 仪器与试剂
    waters高效液相色谱仪,包括:2487紫外-可见光分光光度检测器,515液相色谱泵,rheodyne7725i型手动进样器,millennium 2010软件.蠕动泵,自动馏分收集器.agilent1100 hplc ms联用仪.
    金银花药材(其中绿原酸的含量为3%)由同仁堂药店提供,对照品(纯度大于98%)由中国药品生物检定所提供.
    甲醇(色谱纯)、乙醇、丙酮、冰醋酸、盐酸和氢氧化钠(分析纯),流动相和溶液配制均使用石英亚沸蒸馏器的二次蒸馏水.
    1.2 色谱分析条件
    色谱柱为symmetry rp18柱(150mm ×3.9mm i.d.、5μm ),流动相为甲醇-水(40:60),含1%(v/v)冰醋酸;流速为1.0 ml/min;检测波长325nm;进样体积2oμl.
    1.3 实验方法
    1.3.1 检测方法的建立
    1)标准品溶液的制备**称取绿原酸对照品2.4mg置于50mg量瓶中,加入流动相溶解并稀释到刻度,摇匀,得每1ml含0.048mg的对照品溶液.
    2)线性关系考察精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 ml,分别置于10ml量瓶中,加入流动相稀释至刻度.精密吸取上述对照品溶液2oμl,注入色谱仪,测得色谱峰面积.以进样量c(μg)对峰面积a进行线性回归(n=5),得回归方程a=3025147c一587329(r=0.998).结果表明,绿原酸在进样量0.096~0.48 μg范围内呈良好的线性关系.
    3)精密度试验对照品和样品溶液各2oμl,按色谱条件分别重复进样1o次(每次20μl),测定色谱峰面积,其相对标准偏差rsd分别为0.9 0/0和1.7%。
    4)稳定性试验 精密吸取对照品溶液2oμl,分别于0、2、4、6、8、10、12h注入色谱仪,按色谱条件测得色谱峰面积·其rsd为1.5 %.同时对样品重复上述试验,rsd为2.3%,表明对照品和供试品在12h之内稳定.
    5)重复性试验在同日内和不同日期,取同一批样品,分别由不同操作者,制备供试品溶液,测定绿原酸的含量5次,其日内rsd为1.8%,日间的rsd为2.9%,表明重复性好.
    1.3.2 ph稳定性试验
    用0.1mol/l 的盐酸或氢氧化钠溶液调节绿原酸提取液的ph至3~8之间,盛于棕色瓶中,4℃冰箱中待测.
    1.3.3 样品分离纯化
        **次采用95%乙醇、后两次采用5o%的乙醇水溶液,固液比均为1:1o,调节溶液的ph约为3,5o℃左右提取3次.合并提取液,浓缩至无醇味,4℃ 冰箱冷藏过夜,抽滤得上清液,待用.酸、碱、醇处理好的聚酰胺树脂装于玻璃柱(400×10mm)中,缓慢加入上步上清液至流出液变浑浊,依次用水、10%、2o%、3o%、4o%和5o%乙醇水溶液(盐酸调节ph至4.0左右)梯度洗脱,hplc检测合并绿原酸含量大于6o%的洗脱液,浓缩后置于0℃冰箱中析晶,抽滤.上述晶体溶于适量水中,加于sephadexlh-20柱柱顶.层析条件为洗脱剂5o%的丙酮水溶液(ph-4)、流速0.5ml/min.自动馏分收集器收集,hplc检测,合并绿原酸洗脱液,减压浓缩,冷冻干燥得绿原酸纯品.
    2 结果与讨论
    2.1 hplc条件和检测方法
    hplc为常用的定性定量分析方法.由于绿原酸溶于水后有部分解离,导致检测色谱峰拖尾和分析结果重现性差等问题,因此有必要在流动相中添加酸性物质,抑制绿原酸的解离.检测方法实验证明1的冰醋酸改性的流动相可以有效的分析绿原酸成分.
    2.2 ph稳定性分析
    文献报道[8],光照或加热条件导致绿原酸的分解.其原因可能为绿原酸结构中的羧酸基团或邻二酚羟基易于发生反应.hplc检测结果显示,绿原酸提取液的ph值处于3-5时,绿原酸比较稳定.表明在这种情况下绿原酸的含量不随时间的变化而降低.
    2.3 聚酰胺树脂的梯度洗脱分离
在各个梯度乙醇洗脱液中,绿原酸集中出现在3o%乙醇的洗脱液中.为了增加绿原酸与提取液中其他杂质成分的分离度,结合稳定性实验,用盐酸溶液调节洗脱液的ph至4左右.
    推测在这种情况下,绿原酸分子处于未解离状态,吸附在聚酰胺树脂的表面,2o%及其以下的乙醇水洗脱液中不含有绿原酸成分,3o%的乙醇水溶液可以洗脱,同时杂质含量明显降低,绿原酸的纯度大于6o%,此时的回收率大于7o%.
    2.4 sephadex lh-20纯化
    经预实验分析,选择ph(3、4和5),洗脱剂(50%甲醇水、5o%乙醇水和5o%丙酮水),流速(o.5ml/min、1.0 ml/min和1.5ml/min做如下正交实验.
    经过spss统计软件分析,*优的分离条件为:ph为4、洗脱剂为5o%的丙酮水溶液和流速0.5ml/min.经过一次sephadex lh-2o分离,得到纯度98%以上的绿原酸108mg.
    2.5 结构鉴定
    纯化得到的白色针晶,hplc测定为一单峰,nm:329.7.ir/cm:3362(-oh)、1726(c=o)、1687、1640、1601、1289、1191、969、818.esi/ms m/z:377.2[m na] ,353.2[m-h]-,与标准品比较结果一致.推断该化合物确为绿原酸.
参考文献
[1] 国家中医药管理局(中华本草)编辑委员会.中华本草[m].上海:上海科学技术出版社,1999
[2] 高锦明,张鞍灵,张康健,等.绿原酸分布、提取与生物活性研究综述[j].西北林学院学报,1999,14(2):73—82
[3] 武雪芬,彭仁武,张村,等. 环糊精在绿原酸分离中的应用研究[j].河南科学,1999,17(4);385—387
[4] 马希汉.张康健,尉芹,等.从杜仲叶中提取绿原酸纯品的研究[j].西北林学院学报,1996,11(2):58—60
[5] 王志华,壬东洁,赵晋府.葵花籽绿原酸酶法提取工艺研究[j].食品科学,2004,25(1):97一101
[6] 彭密苇,周春山,钟世安,等.制备型高效液相色谱法分离纯化绿原酸[j].中南大学学报(自然科学版),2004,35(3):


 
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